Language
Chinese
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Product Information
| Description | Myelin Basic Protein rabbit polyclonal |
| Protein full name | Myelin Basic Protein |
Synonyms | MBP, entrez:4155, myelin basic protein |
| Immunogen | Recombinant protein corresponding to Mouse Myelin Basic Protein |
| Isotype | IgG |
| Purity | Affinity purification |
| Subcellular location | Myelin membrane,Cytoplasmic side of myelin |
| Uniprot ID |
Applications
| Applications | IHC,IF | |
| Species | Mouse,Rat | |
| Dilution | 1:500-1:2000 | |
| Positive tissue | brain |
Background
The classic group of MBP isoforms (isoform 4-isoform 13) are with PLP the most abundant protein components of the myelin membrane in the CNS. They have a role in both its formation and stabilization. The non-classic group of MBP isoforms (isoform 1-isoform 3/Golli-MBPs) may preferentially have a role in the early developing brain long before myelination, maybe as components of transcriptional complexes, and may also be involved in signaling pathways in T-cells and neural cells. Differential splicing events combined to optional post-translational modifications give a wide spectrum of isomers, with each of them potentially having a specialized function.
Images
| Immunohistochemistry analysis of paraffin-embedded mouse brain using Myelin Basic Protein (GB11226-1) at dilution of 1:1600 |
| Immunohistochemistry analysis of paraffin-embedded rat brain using Myelin Basic Protein (GB11226-1) at dilution of 1:800 |
Storage
| Storage | Store at -20 ℃ for one year. Avoid repeated freeze/ thaw cycles. |
| Storage Buffer | PBS with 0.02% sodium azide, 100 μg/ml BSA and 50% glycerol. |
NOTE: This product is intended for research only.
实验操作步骤
一、石蜡切片免疫组化实验步骤
主要实验试剂
试剂 | 厂家 | 货号 | 操作 |
无水乙醇 | 国药集团化学试剂有限公司 | ||
二甲苯 | 国药集团化学试剂有限公司 | ||
双氧水 | 国药集团化学试剂有限公司 | ||
石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗。
抗原修复：组织切片置于盛满修复缓冲液的抗原修复盒中于微波炉内进行抗原修复，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%过氧化氢溶液，室温避光孵育25 min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
BSA或者血清封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）
加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加组化试剂盒内与一抗相应种属的二抗（HRP标记）覆盖组织，室温孵育50min。
DAB显色：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。
复染细胞核：Harris苏木素复染3min左右，自来水洗，1%的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。
脱水封片：将切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min --无水乙醇Ⅰ6min -无水乙醇Ⅱ6min -二甲苯Ⅰ5min 中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
显微镜镜检，图像采集分析。
二、石蜡切片免疫荧光实验步骤
主要实验试剂
试剂 | 厂家 | 货号 | 操作 |
无水乙醇、二甲苯 | 国药集团化学试剂有限公司 | ||
石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗。
抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH9.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火至沸后断电间隔10min中低火至沸，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(修复液和修复条件根据组织来确定）
加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）
加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
DAPI复染细胞核：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。
三、Western Blot实验步骤
主要试剂
试剂 | 厂家 | 货号 裂解液体系 | 操作 |
蛋白Marker | Therm | 26616 | 订购 |
PVDF膜 0.45um | millipore | IPVH00010 | |
PVDF膜 0.22um | millipore | ISEQ00010 | |
TWEEN 20 | Sigma | ||
细胞总蛋白提取
对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA（在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。
对于贴壁细胞:
1、用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。
2、加入适当体积的 RIPA（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5min。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
3、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。
4、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
5、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
组织蛋白提取：
1、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于高速组织研磨仪。加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）匀浆。如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。
2、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
3、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
蛋白浓度测定：BCA法测蛋白浓度
SDS-PAGE电泳
清洗玻璃板
灌胶与上样
1、将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
2、按实验安排配制分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。大约45min后可倒去胶上层水并用吸水纸将剩余水吸干。
分离胶配比
分离胶浓度 | ||||||||||||
试剂 | 8% | 10% | 12% | 15% | 18% | 20% | 8% | 10% | 12% | 15% | 18% | 20% |
H2O ml | 4.63 | 4 | 3.3 | 2.3 | 1.3 | 0.63 | 6.9 | 5.9 | 4.9 | 3.4 | 1.9 | 0.9 |
30％丙烯酰胺（29：1） ml | 2.67 | 3.3 | 4 | 5 | 6 | 6.67 | 4 | 5 | 6 | 7.5 | 9 | 10 |
1.5M TRIS－Hcl(PH 8.8) ml | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 3.8 | 3.8 | 3.8 | 3.8 | 3.8 | 3.8 |
10％SDS ml | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 |
AP ml | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 |
TEMED ul | 5ul | 5ul | 5ul | 5ul | 5ul | 5ul | 7.5ul | 7.5ul | 7.5ul | 7.5ul | 7.5ul | 7.5ul |
总体积 ml | 10ml | 15ml | ||||||||||
5%浓缩胶配比
试剂 | 浓度 5% | |||
H2O ml | 2 | 3 | 4 | 6 |
30％丙烯酰胺（29：1）ml | 0.5 | 0.75 | 1 | 1.5 |
1M TRIS－Hcl(PH 6.8)ml | 0.5 | 0.75 | 1 | 1.5 |
10％SDS ul | 40 | 60 | 80 | 120 |
AP ul | 30 | 45 | 60 | 90 |
TEMED ul | 4ul | 6ul | 8ul | 12ul |
总体积 ml | 3ml | 4.5ml | 6ml | 9m |
1、按前面方法配5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
2、加足够的电泳液后上样电泳。将样品加入电泳孔中，电泳。浓缩胶电压75V，分离胶用120V。电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
转膜 （小于20kd的蛋白请使用0.22um的PVDF膜。）
1、准备6张7×9cm的滤纸和一张大小适中的 PVDF膜，PVDF膜在使用之前要先用甲醇活化。
2、在加有转移液的盆里放入转膜用的夹子，两块海绵垫，一支玻棒，滤纸和经过活化的PVDF膜。
3、将夹子打开使黑的一面保持水平。在垫子上垫海绵、三层滤纸。
4、小心剥下分离胶盖于滤纸上，将膜盖于胶上，并除气泡。在膜上盖三张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫。
转膜条件（湿转）
1、快转：300mA恒流转膜半小时，或者200mA转膜1小时，时间可以略微调整，时间对应调整。
2、慢转：转膜过夜，25V恒压转膜过夜。
免疫反应
1、将转好的膜于室温下脱色摇床上用5%的脱脂牛奶(0.5%TBST配)，封闭1h。
2、稀释一抗（TBST溶解的5%脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5%BSA），4℃孵育过夜（快转），或者4℃孵育抗体3小时（慢转）。
3、用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min
4、将二抗用TBST稀释3000倍，室温下孵育30min后，用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min
化学发光 将ECLA和ECLB两种试剂在离心管中等体积混合，将PVDF膜的蛋白面朝上与此混合液充分接触，1-2min后，去尽残液，包好，放入暗匣中曝光。最后用显影、定影试剂进行显影和定影。根据不同的光强度调整曝光条件。
凝胶图像分析 将胶片进行扫描存档，图像处理软件整理去色，图像分析软件处理系统分析目标带的光密度值。
