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稳转细胞系建立

货号:GC1036

品牌:Servicebio

价格:¥2000

规格:

简介: 细胞转染是指将外源分子如DNA、RNA等导入真核细胞的技术。主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、病毒介导的转染等,理想的转染方法是具有高转染效率、对细胞毒性作用小等。其中脂质体转染是常用的简便转染方法。

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  一、实验简介

  细胞转染是指将外源分子如DNA、RNA等导入真核细胞的技术。主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、病毒介导的转染等,理想的转染方法是具有高转染效率、对细胞毒性作用小等。其中脂质体转染是常用的简便转染方法。

  脂质体(liposome)转染方法的原理在于,阳离子脂质体表面带正电荷,能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹,形成DNA-脂复合体,被表面带负电荷的细胞膜吸附。再通过膜的融合或细胞的内吞作用,偶尔通过直接渗透作用,将DNA转运至细胞内,形成包涵体或进入溶酶体。当DNA从包涵体内释放后,进入细胞质,再进一步进入核内实现转录、表达。

  细胞感染是指通过病毒载体将外源分子导入真核细胞。因病毒可以通过自身的侵袭作用进入宿主细胞后,可以利用细胞中的物质和能量以及复制、转录和转译的能力,按照自身核酸所包含的遗传信息产生和它一样的新一代病毒。利用这种特性,去掉病毒的致毒基因并将外源基因片段插入制成病毒载体,进而将目的片段转入受体细胞,使目的基因可以表达,甚至将基因遗传给后代稳定的表达。目前常见用于转染的病毒有,慢病毒,逆转录病毒,腺病毒等。

  二、siRNA/shRNA/miRNA/DNA转染细胞实验步骤(以6孔板为例)

  1 转染前一天接种细胞于6孔板,5×104每孔,第二天转染时细胞汇合度达到60%-70%每孔。

  2 转染前半小时将完全培养基换无血清培养基1.9 ml。

  3 A液:RNA100pmol/DNA 2μg(根据核酸类型不同,用量不同)加入50 ul Opti-MEM无血清培养基,轻轻混匀,室温静置5min。

  4 B液:脂质体使用前轻轻混匀,脂质体5ul 加入50 ul Opti-MEM无血清培养基,轻轻混匀,室温静置5min。

  5 B液加入到A液中,用枪轻轻混匀,室温静止20min。

  6 将混合液均匀分散慢慢滴加到6孔板细胞中,边滴加边前后左右十字交叉轻轻摇晃。

  7 孵箱37℃培养4~6h,然后将无血清培养基换成完全培养基继续培养。

  8 mRNA 水平的检测:在转染后24-48h后,用Real-time PCR的方法在mRNA水平进行检测。

  9 蛋白水平的检测:在转染后48-72h后,用Western-blot或免疫组化的方法在蛋白水平进行检测。

  三、细胞感染实验步骤(以慢病毒感染为例)

  1、转染前一天,取2-3×105cells/well的细胞接种在6孔板上,培养24h后将原有培养基弃去,加入2mL的细胞完全培养基。

  2、置于CO2浓度为5%的培养箱中于37℃培养至细胞汇合达到40-60%。

  3、细胞换液,将病毒液与终浓度5μg/ml polybrene加入新鲜培养基中。8-12h后观察细胞状态,若细胞状态无明显病变,继续培养,24h后更换新鲜培养基。

  4、根据公式计算病毒用量 (细胞数×MOI值/病毒原液滴度)×103=病毒用量(μl)

  5、72-96h察荧光表达情况,对生长代谢缓慢的细胞,可适当延长观察时间,并及时换液和传代维持细胞生长状态。

  注意:感染细胞最佳MOI的测定:MOI(感染复数)是指每个细胞感染的病毒数。通常MOI高,病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。对于分裂活跃的细胞,例如HeLa、293细胞,MOI=1-3时,80%以上细胞均表达目的基因。而对于非活跃的细胞,如原代细胞,感染效率较低,需要进行MOI浓度摸索实验,选择合适的MOI后再进行后续实验。