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SYBR GREEN PCR master mix

货号:WG04913914001

品牌:Roche

价格:¥1150

规格: 5ml,200T

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/e/DownSys/DownSoft/?classid=251&id=2005&pathid=0

产品简介

  SYBR® Green Fast qPCR Mix是SYBR® Green I嵌合染料法专用qPCR试剂,为2×预混液,包含除引物和DNA样品以外的所有qPCR组分,可减少操作步骤,缩短加样时间,降低污染几率。其核心组分是经抗体修饰的热启动Taq DNA聚合酶,配合精心优化的Buffer体系,以及PCR反应促进因子,使产品具有特异性强、扩增效率高,反应时间短等特点,有效抑制非特异性扩增,可对宽广浓度范围内的模板进行准确定量,获得稳定可靠的qPCR结果。

产品组成

G3006 SYBR® Green Fast qPCR Mix (None ROX) 5×1 mL
G3007 SYBR® Green Fast qPCR Mix (Low ROX) 5×1 mL
G3008 SYBR® Green Fast qPCR Mix (High ROX) 5×1 mL

内附:Nuclease-Free Water 5×1 mL

试剂盒外必备主要试剂和仪器

  1.Real Time PCR 扩增仪

  2.实验专用反应管或反应板

  3.PCR 引物(参考引物设计原则)

  4.微量移液器和枪头(已高压灭菌)

储运条件

  长期保存请于-20℃避光保存,避免反复冻融,Mix融解后可在4℃避光条件下稳定存放一个月。

使用注意

  1.使用前请上下轻轻颠倒混匀,请勿涡旋振荡混匀,避免产生气泡,试剂混匀后再使用。试剂混合不均匀会造成反应效果不佳。

  2. 配制反应液时,试剂请于冰上放置。

  3. 本制品中含有荧光染料 SYBR Green,配制 PCR 反应液时应避免强光照射。

  4. 反应液的配制、分装请一定使用新的一次性枪头、尽量避免样品间的污染。

  5. 避免反复冻融Mix,融解后尽量在一个月内使用完毕。

使用方法

1. 建议的qPCR反应体系

试剂 使用量 使用量 终浓度
SYBR® Green Fast qPCR Mix 10 μL 25μL
正向引物(10 μM)a 0.4 μL 1μL 0.2 μM
反向引物(10 μM)a 0.4 μL 1μL 0.2 μM
DNA模板b X μL X μL 10~200 ng/20 μL
Nuclease-Free Water To 20 μL To 50 μL  

  a.通常引物终浓度为 0.2 μM 可以得到较好结果。反应性能较差时,可以在 0.2~1.0 μM 范围内调整引物浓度。

  b.模板添加量因模板溶液中存在的靶基因的拷贝数不同而不同,进行梯度稀释研讨适当的模板添加量。在 20 μL 反应体系中模板 DNA 添加量最好在 100 ng 以下。以 RT-PCR 反应的 cDNA(RT 反应液)为模板时,添加量不要超过 PCR 反应液总体积的 10%.

 

2.PCR反应程序(可根据机型适当调整)

A.两步法
Stage 1:预变性      
Reps:1      
95℃  30 秒     
Stage 2:PCR 反应     
Reps:40      
95℃  10 秒      
60℃  30秒*       荧光信号采集
Stage 3:Melt Curve     荧光信号采集
 
B.三步法
Stage 1:预变性      
Reps:1   
95℃     30 秒     
Stage 2:PCR 反应     
Reps:40      
95℃     10 秒      
55~65℃  10秒        
72℃     30秒* 荧光信号采集
Stage 3:Melt Curve  荧光信号采集

  需提高扩增特异性,可使用两步法程序或提高退火温度;需提高扩增效率,可使用三步法程序或延长延伸时间。

 

适配机型

  G3008
(High ROX)
G3007
(Low ROX)
G3006
(None ROX)
ABI Thermo life 5700/7000/
7300/7700/
7900/7900HT/
7900 HT Fast,StepOne™,
StepOne Plus™
7500/7500 Fast,
 ViiA 7™
QuantStudio™ 系列
PikoRealTM Cycler
Stratagene   Mx3000P®/3005P™/4000™  
Bio-Rad     全系列
Eppendorf     Realplex 2s,
Mastercycler® ep realplex
IIIumina     Eco QPCR
Cepheid     SmartCycler®
Qiagen Corbett     Rotor-Gene® 系列
Roche     LightCycler™ 系列
Takara     Thermal Cycler Dice系列
Analytikjena     qTOWER系列
杭州博日     LineGene系列

 

引物设计原则

  A.扩增产物长度建议控制在80~300 bp;

  B.引物长度:18~25 bp;

  C.引物G十C含量应在40%~60%之间;

  D.正向引物和反向引物的Tm值相差不超过2℃ 为佳,Tm值控制在58~62℃ 为佳;

  E.碱基分布的随机性;

  F.引物自身最好不要含有自身互补序列,否则会形成发夹样二级结构;

  G.引物之间两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基,不然会形成引物二聚体,尤应避免3’端的互补重叠;

  H.3’末端如果可能的话,每个引物的3‘末端碱基应为G或C;

  I.NCBI上的比对结果无其他非特异性产物出现。

 

常见问题及解决方法

问题描述 可能原因 解决办法
反应结束无扩增曲线出现或者Ct值出现过晚 模板浓度过低 减少模板稀释倍数重复实验,样品浓度未知的情况下先从最高浓度做起
模板降解 重新制备模板,重复实验
体系中存在PCR抑制剂 一般为模板带入,加大模板稀释倍数或重新制备纯度高的模板重复实验
引物可能降解 长期未用的引物,应先通过PAGE电泳检测完整性,以排除其降解的可能
扩增效率低 提高引物浓度,尝试三步法扩增程序,或者重新设计引物
扩增产物过长 扩增产物长度控制在80~300 bp
空白对照出现信号 反应体系污染 首先更换空白对照的水,如果还发生同样情况,继续更换引物、吸头、PCR管或启用新的Mix
反应体系在超净工作台内配制,减少气溶胶污染
出现引物二聚体等非特异性扩增 一般在35循环以后空白对照出现扩增产物属正常情况,应配合熔解曲线进行分析;重新设计引物,调整引物浓度或优化PCR反应程序
熔解曲线出现多峰 引物设计不佳 根据引物设计原则重新设计新引物
引物浓度过高 适当降低引物浓度
cDNA模板存在基因组污染 提取后的RNA溶液使用DNA酶进行消化,例如:dsDNase,以去除基因组污染,或设计跨内含子引物
实验重复性差 加样误差大 使用精准的移液器、配合高品质吸头准确移液;高倍稀释模板,加入大体积模板减少加样误差;放大qPCR反应体积
模板浓度过低 减少模板稀释倍数重复实验
qPCR仪不同位置的温度偏差 定期校准qPCR仪
扩增曲线不光滑 荧光信号太弱,经系统校正后产生 确保Mix中预混的染料未降解;更换荧光信号收集更好的qPCR专用耗材
扩增曲线断裂或下滑 模板浓度较高,基线的终点值大于Ct值 减小基线终点(Ct值-3), 重新分析数据
个别孔扩增曲线突然骤降 反应管内留有气泡 确保Mix完全溶解,请勿涡旋振荡混匀
加样完成后轻弹离心去除气泡
延长预变性时间至10 min,以去除气泡

 

  附图:

  上图:RealTimeRT-PCR对RatTGFβ1mRNA进行了检测,模板使用3倍系列稀释

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