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免疫组化/荧光

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荧光双重染色试剂盒

货号:G1225-100T

品牌:Servicebio

价格:¥3000

规格:

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  产品简介:

  该试剂盒适用于石蜡切片免疫荧光双重染色,既可用于相同来源抗体的双染, 也可用于不同来源抗体的双染。其主要原理是利用酪酰胺信号放大(TSA)技术, 在 HRP 的作用下,荧光素标记的信号增强剂在能够与抗原结合,通过微波处理去除结合的一抗二抗,但不会影响荧光素标记的增强剂与抗原的结合,因此不会 与后加入的一抗二抗发生交叉反应,从根本上解决了荧光同源双标串色的问题。此外还能够放大阳性信号,提高低丰度蛋白的检测效果。

  包装内容:

产品货号 产品名称 规格
G1225-1 A 液:信号增强剂(FITC 标记) 50μL
G1225-2 B 液:信号增强剂(CY3 标记) 50μL
G1225-3 C 液:稀释液 20ml
G1225-4 D 液:封闭液 1 20ml
G1225-5 E 液:封闭液 2 20ml
G1225-6 F 液:DAPI 20ml
G1225-7 G 液:自发荧光淬灭剂 20ml
G1225-8 H 液:抗荧光淬灭封片剂 20ml

  保存条件:

  整套试剂 4℃避光保存,有效期 3 个月。

  客户自备试剂:

  1.0.01mol/L pH7.4 的 PBS 缓冲液。

  2.HRP 标记二抗(同源双标一个二抗,异源双标相同来源的两个二抗)。

  使用方法:

  第一抗体孵育:

  1.脱蜡、水化组织切片;

  2.根据所应用的一抗的特殊要求,对组织切片进行抗原修复;

  3.PBS 洗 3 次,每次 5 分钟

  4.加入 100μL D 液孵育 10 分钟,阻断内源性过氧化物酶,以减少非特异性背景染色;

  5.PBS 洗 3 次,每次 5 分钟,组化笔画圈;

  6.加入 100μL E 液孵育 30 分钟来减少非特异性染色(血清封闭);

  7.甩掉 E 液,加第一个一抗(一抗浓度按照抗体说明书建议浓度降低 5-10 倍配制,配制好的一抗工作液置于离心机中 12000 转离心 5 分钟,滴加一抗时, 吸取上层的,底部的 30μL 舍弃不用),避光湿盒 4℃过夜孵育;

  8.PBS 洗 3 次,每次 5 分钟;

  9.加入配制的 HRP 标记二抗(针对第一个一抗),室温孵育 50 分钟;

  10.PBS 洗 3 次,每次 5 分钟;

  11.加入 100 μL 用 C 液稀释的信号增强剂 A 或者 B 工作液(A 液或 B 液:C 液=1:500。 配制好的信号增强剂工作液,至于 12000 转离心 5 分钟,吸取上层的,底部 30 μL 舍弃不用),避光湿盒室温孵育 10 分钟;

  12.PBS 洗 3 次,每次 5 分钟;

  第二抗体孵育:

  1.超纯水洗 2 次,每次 5 分钟;

  2.将切片放入盛有抗原修复液的修复盒内进行微波处理,维持 95℃以上温度15 分钟,自然冷却至室温;

  3.PBS 洗 3 次,每次 5 分钟;

  4.加入 100μL E 液孵育 10 分钟;

  5.甩掉 E 液,加第二个一抗(一抗浓度按照抗体说明书建议浓度降低 5-10 倍配制,配制好的一抗工作液置于离心机中 12000 转离心 5 分钟,滴加一抗时, 吸取上层的,底部的 30μL 舍弃不用),避光湿盒 4℃过夜孵育;

  6.PBS 洗 3 次,每次 5 分钟;

  7.加入配制的 HRP 标记二抗(针对第二抗体的),室温孵育 50 分钟;

  8.PBS 洗 3 次,每次 5 分钟;

  9.加入 100μL 用 C 液稀释的信号增强剂 B 或者 A 工作液(A 液或 B 液:C 液=1:500。 配制好的信号增强剂工作液,至于 12000 转离心 5 分钟,吸取上层的,底部 30 μL 舍弃不用)室温孵育 10 分钟;

  10.PBS 洗 3 次,每次 5 分钟;

  11.加入 100μL F 液 DAPI 染核,室温孵育 5 分钟;

  12.超纯水冲洗,加入 100μL G 液,孵育 5 分钟,淬灭组织自发荧光;

  13.流水冲洗 20 分钟(勿正对组织);

  14.滴加 100μL H 液,50mm×50mm 盖玻片封片。

  注意事项:

  1.实验操作应避光进行(暗环境);

  2.PBS洗涤要充分,减少非特异性着色;

  3.一抗浓度按说明书推荐浓度降低5-10倍稀释;

  4.实验操作过程中避免组织干片;

  5.试剂现配现用。

  常见问题及解决方案:

分类 可能原因 优化方案
 
无阳性信号
抗体效价低 安排对照实验,确认一抗二抗效果
抗原修复偏弱 提高抗原修复强度
 
 
阳性信号弱
抗体浓度低 提高一抗浓度
抗原修复偏弱 提高抗原修复强度
增强剂孵育时间短 延长增强剂的孵育时间
 
 
非特异性着色多
抗体浓度过高 降低抗体浓度
增强剂孵育时间过长 缩短增强剂的孵育时间
封闭效果不佳 延长试剂D,E 的孵育时间

  图例:

大鼠脑 NEUN(绿光)+MBP(红光)

H 睾丸癌 CD68(绿光)+CD8(红光)

大鼠脑 GFAP(绿光)+NEUN(红光)

H 肾 α-SMA(绿光)+CD31(红光)